Pitanje:
Što određuje uspješnu ekspresiju proteina u E. coli?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Neki se proteini dobro izražavaju u heterolognom domaćinu; drugi- nemojte. Poznato je nekoliko zahtjeva za određivanje ekspresije proteina, poput snažnog promotora (poput T7) za transkripciju i jakog mjesta vezanja ribosoma za prijevod. Radim s proteinom koji se sastoji od 2 podjedinice - alfa i beta. Oboje su na plazmidu s T7 promotorom ispred beta podjedinice (tj. Konstrukt je T7 promotor, CDS za beta podjedinicu, CDS za alfa podjedinicu). Beta podjedinica se dobro izražava, ali alfa ne. Mislite li da ovo ima neke veze s lokalnim okolišem (promotori, RBS itd.) I koliko to ovisi o tome? Kako mogu povećati ekspresiju proteina?

Neki mi aspekti nisu potpuno jasni. Dvije podjedinice su eksprimirane u odvojenim plazmidima, ili? I sve je u plazmidima isto, osim stvarne sekvence proteina?
Dvije podjedinice nalaze se na istom plazmidu. Sekvenca plazmida započinje s T7 promotorom, RBS1, podjedinicom beta, RBS2, podjedinicom alfa. RBS sekvence su malo drugačije, pa sam ih razmišljao napraviti jednakima, ali to ne bi trebalo imati velik učinak na ekspresiju proteina. (vrlo su bliski konsenzusnom slijedu).
četiri odgovori:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jedan važan aspekt prilikom ekspresije proteina iz drugog organizma u E. coli jest da se upotreba kodona u izvornom organizmu vjerojatno razlikuje od upotrebe kodona u E. coli koja se koristi za ekspresiju ( pristranost zbog upotrebe kodona).

Iako je genetski kod degeneriran, nisu svi kodoni jednaki. Oni mogu kodirati istu aminokiselinu, ali organizmi imaju tendenciju davati prednost određenim kodonima u odnosu na druge, a tRNA za te kodone obično su prisutne u različitim koncentracijama. Kad sada u svom slijedu imate puno kodona koji su vrlo rijetki u E. coli, izraz će patiti jer tRNA za te kodone nije prisutna u dovoljno visokim koncentracijama da održi translaciju.

Tamo dva su načina da se to kompenzira, ili dobivate da E. coli proizvede više rijetkih tRNA ili optimizirate svoj slijed da biste koristili različite kodone. Kao prvo rješenje možete kupiti određene sojeve E. coli koji sadrže plazmide koji kodiraju tRNA koji su rijetki u E. coli, jedan od tih sojeva je na pr. soj Rosetta BL21.

Za optimizaciju upotrebe kodona postoji nekoliko tvrtki koje nude sintezu optimiziranih sekvenci. Postoje i alati dostupni na mreži, ali ja nemam izravnog iskustva s njima.

Optimizacija također nije tako laka kao što je upotreba najrasprostranjenijeg kodona svaki put, pokazalo se da optimizacija kodona odgovara brzina prevođenja u izvornom organizmu može povećati prinose ekspresije. Nekim proteinima mogu biti potrebna mjesta pauze tijekom prevođenja kako bi se osiguralo pravilno presavijanje. Ako se protein ne savije pravilno, brzo će se razgraditi i vaš će prinos patiti. To je opisano u članku "Heterologna ekspresija proteina poboljšava se usklađivanjem frekvencija upotrebe kodona ciljnog gena s frekvencijama domaćina ekspresije" autora Angov i sur.

Lijep pregled cijele teme pronaći ćete u članku "Vi ste jedan u googolu: optimiziranje gena za ekspresiju proteina" iz Welsh i sur.

Hvala, ludi znanstveniče! Da, razmišljao sam o optimizaciji kodona i ovo je definitivno na mom popisu za obaviti. Žao mi je što sam to zaboravio spomenuti. DNA 2.0 ima softver koji će pretvoriti vašu sekvencu u optimiziranu. Čula sam i za Rosettu BL21, ali nikada je nisam koristila. Možda bismo se željeli držati vlastitog soja, jer je on heterologni proizvođač ili lijek od interesa. Pomalo me brine optimizacija kodona, upravo zbog pogrešnog savijanja, ali smatram da bismo to trebali učiniti.
Ali to još uvijek ne objašnjava zašto se druga podjedinica bolje izražava, kao što su i drugi proteini iz istog izvornog organizma dobro izraženi u E. coli. Zato mislim da je više pitanje o kontrolnim elementima transkripcije i prevođenja, a ne o rijetkoj upotrebi kodona.
@GerganaVandova Trebali biste usporediti upotrebu kodona svoje dvije podjedinice, možda slučajno jedan koristi rjeđe kodone od druge.
Prisustvujem predavanju Claesa Gustafssona iz DNA2.0 - i pretpostavljam da smo to već znali - da je upotreba kodona korisna, ali ne uvijek djeluje. imaju vlasničku metodu koja je pouzdanija ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jeste li pokušali svoja dva gena staviti na dva odvojena plazmida (naravno s različitim podrijetlom replikacije i odabirom antibiotika) i na taj način suiskazati? Ako se prva od dvije podjedinice dobro izražava, a druga ne, to je vjerojatno zato što ribosomi padaju s mRNA prije nego što u potpunosti transkribiraju drugi gen. Jesu li geni eukariotskog podrijetla? Mislim da je teško "prevariti" ribosome E. coli u liječenju heterolognih sekvenci kao operona, ali možda bi netko tko ima više znanja o prokariotskom prijevodu mogao pomoći.

Zapravo, samo dodavanje drugog promotora T7 ispred gena 2 vjerojatno bi prilično pomogao:

Geni se transkribiraju ili s pojedinih promotora ili s jednog promotora, što dovodi do duge polikistronske mRNA. Izvješteno je da polikistronska ekspresija dovodi do slabije ekspresije proteina kodiranog nizvodno, što se može iskoristiti da utječe na stehiometriju proteinskog kompleksa (9). Zabilježena je nekoliko puta veća ekspresija s pojedinačnim promotorima u usporedbi s polikistronskom transkripcijom (10). ( Izvor)

Iz osobnog iskustva znam da koekspresija pomoću dva plazmida može vrlo dobro raditi s pravim genima!

Hvala na odgovoru. Sviđa mi se ideja da dodam dodatni T7 promotor, iako bi ponavljanje sekvenci moglo dovesti do drugih budućih problema (ne želim ulaziti u detalje). Ali radim s genima koji su 3 puta veći, a jedan promotor za dvije podjedinice dobro djeluje. Možda je vrlo specifičan za slijed.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ludi znanstvenik pokrivao je potencijalna pitanja pristranosti kodona (koja se mogu poboljšati pomoću Rosettas-a), ali općenitije, vidio sam ogromnu varijabilnost u stopama ekspresije između različitih vektora (pET-28 vs pET-24) bez ikakvog vidljivog razloga. Naš je laboratorij postigao izuzetan uspjeh s IPTG inducibilnim vektorima (od pBC-SK do pET-24 povećana ekspresija 50 puta).

Osim ekspresije, protein se može izgubiti prilikom pripreme ekstrakta bez stanica. Možda se neće nalaziti u staničnoj kuglici ako se izvozi zahvaljujući signalnom peptidu ili se može baciti u peletu "krhotine" kada se vrti niz lizirane stanice ako je slabo topljiva. Čula sam teoriju da problemi s topljivošću mogu pretjerivati ​​vektori koji zasićuju izvozne strojeve, koji mogu i ometati sintezu i / ili biti toliko učinkoviti da samo uzrokuju oborine. Priručnik za sustav pET sugerira da dulje vrijeme ekspresije (preko noći) pri nižim (15-20 ° C) može pomoći u rješavanju problema s topljivošću. Bez obzira na razlog, inženjering signalnog peptida drastično je povećao ekspresiju mnogih naših proteina.

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Pronašao sam vrlo lijep rad: Dizajniranje gena za uspješno izražavanje proteina, koji pokriva većinu čimbenika koji određuju ekspresiju proteina. Objavljujem njegove dijelove, jer sam siguran da će nekima od vas biti korisno.

Prijevodom se može upravljati na razini inicijacije i produljenja. Iniciranje translacije prvenstveno ovisi o slijedu mjesta vezanja ribosoma (RBS) i ranoj sekundarnoj strukturi mRNA. Ostale odrednice ekspresije proteina manje su razumljive, ali jednako snažne.

1. Iniciranje prijevoda

Ključna komponenta koja utječe na pokretanje prijevoda kod prokariota je RBS koji se javlja između 5 i 15 baza uzvodno od otvorenog okvira za čitanje (ORF) AUG početni kodon. Vezivanje ribosoma za sekvencu Shine – Dalgarno (SD) unutar RBS-a lokalizira ribosom za inicijacijski kodon ... Srodnost RBS-a za ribosom je kritični čimbenik koji kontrolira učinkovitost s kojom novi pokreću se polipeptidni lanci. Ova interakcija je u konkurenciji s mogućim interakcijama uparivanja baza koje uključuju RBS regiju koje se mogu stvoriti unutar same mRNA. Dakle, SD sekvence sa slabijim uparivanjem baze s ribosomom osjetljivije su na interferenciju od strukture mRNA. Međutim, neki eksperimenti sugeriraju da SD sekvence s prejakim afinitetom mogu biti štetne, posebno pri snižavanju temperatura, usporavanjem početnog produljenja. Također je kritična udaljenost između RBS-a i startnog kodona s 5-7 baza od konsenzusa SD AGGAGG koja je optimalna.

Brojni dokazi sugeriraju da početnih 15-25 kodona ORF-a zaslužuju posebno razmatranje u optimizaciji gena. Studije su pokazale da je utjecaj rijetkih kodona na brzinu prevođenja posebno jak u ovih prvih kodona, kako za ekspresiju u Escherichia coli tako i u Saccharomyces cerevisiae. U E. coli čini se da je otpuštanje peptidil-tRNA tijekom prevođenja početnih kodona naglašeno prisutnošću rijetkih NGG kodona. Čini se da su ti učinci neovisni o lokalnoj sekundarnoj strukturi mRNA. Tačno je i da se ekspresija može oporaviti zamjenom 5 'sekvence čak i za sekvence koje ne pokazuju posebno jaku strukturu mRNA ili sadrže rijetke kodone ili druge očite štetne elemente u ovoj regiji.

2. Kodona pristranost

Drugi način na koji se frekvencije kodonskog domaćina mogu koristiti je podudaranje frekvencija kodonskog domaćina u dizajniranom genu. To se može učiniti jednostavnim odabirom svakog kodona s vjerojatnošću koja se podudara s učestalošću kodona domaćina ... Korištenje skupova gena široko različitih u značajkama dizajna gena, Welch i sur. otkrili su da su varijacije u učestalosti korištenja sinonimnih kodona imale dubok utjecaj na količinu proteina proizvedenih u E. coli, neovisno o lokalnim učincima 5 ’sekvence. Varijacije u izrazu od najmanje dva reda veličine viđene su zbog supstitucije izvan početnih 15 kodona ORF-a. Ova je varijacija bila u snažnoj korelaciji s globalnom učestalošću upotrebe kodona gena, iako frekvencije kodona pronađene u najviše izraženim varijantama nisu odgovarale onima pronađenim u genomu ili u visoko izraženim endogenim genima E. coli. Multivarijantna analiza pokazala je da učestalosti specifičnih kodona za oko šest aminokiselina mogu predvidjeti uočene razlike u ekspresiji. Nije jasno koja je biokemijska osnova za ovu korelaciju.

3. struktura mRNA i translacijsko produljenje

Iako mnogi dokazi sugeriraju da struktura mRNA može ometati translacijsku inicijaciju i kod prokariota i kod eukariota, učinci strukture na produljenje manje su poznati. To je dijelom moguće zbog vlastite helikazne aktivnosti ribosoma, koja omogućuje translaciju čak i vrlo jakim ukosnicama i može spriječiti mnoge strukture da ograniče brzinu translacije bilo u prokarionima ili eukariotima. Možda je još važnije, strukturu mRNA teško je predvidjeti, posebno za aktivno prevedene poruke koje su u kontinuiranom protoku između različitih presavijenih i nerasvijećenih stanja.

4. Čimbenici specifični za proteine ​​koji pružaju dodatnu složenost

Protein može biti posebno nestabilan u domaćinu, posebno ako je loše presavijen zbog svojstvene nestabilnosti, nedostatka dovoljnih protetskih čimbenika ili nepravilnog post-translacijskog modifikacija ... Ekspresija izlučenih i membranskih proteina može biti ograničena mehanizmima za usmjeravanje tih proteina na membranu. Moguće je čak da proteinska aminokiselinska sekvenca može ograničiti translacijsku učinkovitost. Na primjer, smatra se da se prolin polako prevodi u E. coli, bez obzira na to koji se kodon koristi.

Ekspresija proteina može biti toksična za stanicu što dovodi do nestabilnosti vektor ekspresije ili supresija domaćina sinteze proteina ... Uobičajena strategija smanjenja toksičnosti je smanjenje ekspresije na podnošljive razine. Promotori različite snage mogu biti dragocjeni alati za pronalaženje optimalne brzine ekspresije za maksimalan prinos ... Jedan od potencijalnih načina da se izbjegne toksičnost nekih proteina je usmjeravanje ekspresije na periplazmu ili medij. To se može postići spajanjem N-terminala signalne sekvence sekrecije.

Za više informacija, pročitajte cijeli članak. Također preporučujem čitanje Dizajn parametara za kontrolu ekspresije sintetskog gena u Escherichia coli.

Hvala na poveznicama! I prije sam koristio DNA 2.0 za optimizaciju kodona i sintezu gena i imao sam dobre rezultate - definitivno me zanima čitanje njihovih publikacija.
@Amy: Da, dio rada govori o značajkama DNA2.0, koje smatram vrlo korisnima. Novi sam korisnik i još se uvijek navikavam na njihov softver, ali zasad izgleda prilično lijepo.


Ova pitanja su automatski prevedena s engleskog jezika.Izvorni sadržaj dostupan je na stackexchange-u, što zahvaljujemo na cc by-sa 3.0 licenci pod kojom se distribuira.
Loading...