Pitanje:
Koji je dobar protokol za miniprep za učionicu?
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Pokušavam pronaći dobar protokol za miniprepove plazmida i gledam 3 pripravka koja sam pronašao:

  1. Korištenje fenola / kloroforma
    • ekstrakt s fenolom: kloroform: izoamilalkohol,
    • izopropanol oborina, 12.000 g centrifuge,
    • isprati hladnim 70% etanolom.
  2. Korištenje lizozima
    • liza s lizozimom,
    • ukloniti kuglice,
    • oborina izopropanola,
    • isprati hladnim 80% etanolom.
  3. Korištenjem alkalne lize
    • otvoriti stanice s 80% glukoze u EDTA puferu,
    • dodajte SDS i NaOH,
    • protein / membranu kuglice s octenom kiselinom / acetatom,
    • taloženje ispropanola,
    • isprati hladnim 70% etanolom.

Svi se razlikuju po načinu otvaranja stanica i odvajanju plazmida od ostatka stanice. -- podosta. Može li mi netko pomoći da shvatim koji je protokol ovdje najbolji?

Jeste li sigurni da želite da studenti koriste fenol? Većina laboratorija vjerojatno koristi setove za ekstrakciju DNA (npr. Quiagen MiniPrep). Puno je lakše i ujedno sigurnije.
Revenin odgovor označit ću kao najbolji jer mi najviše pomaže u odabiru između protokola. ali hvala što ste istakli kako su jeftini kompleti qiagen - mislio bih da su puno gori. doista naučite nešto koristeći protokol, ali zaglaviti stupce je jednostavno!
FYI, iako je točno oko 1-2 dolara po pretpremijeri za spin kolone, ali trošak reagensa za SDS / NaOH iznosi oko 40 centi po pripremi. ipak morate napraviti više od 100 priprema, da biste vidjeli uštedu.
Samo sam htio obavijestiti da sam stupce kupio od biobasic-a i iako to nije kao uputa kao ovi osnovni protokoli, oni su sigurno dovoljno jeftini i treba ih razmotriti za učionicu - svi glasovi okolo.
@MadScientist Spin stupci doista su najčešća opcija, ali postoji pedagoški kut: Nema se mnogo toga naučiti o slijeđenju priručnika za kit, ali PCI ekstrakcija podučava neke važne biokemije. Čak i ako se rutinsko pročišćavanje vrši pomoću centrifuga, PCI može biti dragocjena nadoknada kad vam se slučajno zaglavi jer neka nečistoća stalno prolazi kroz vašu kolonu.
na kraju sam razgovarao o tome što čini svaki korak pripreme za zavrtanje i to dobro funkcionira. stare metode zapravo nisu puno rigoroznije kada govorite o pH promjeni afiniteta na silicijum dioksidu, itd
Pet odgovori:
#1
+7
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Protokol koji sam koristio u svom tečaju genetičkog laboratorija bila je alkalna liza praćena taloženjem etanola sličnom ovoj. Ništa užasno otrovno ili što zahtijeva nape (barem u malim količinama).

Praktičnija i pouzdanija metoda je upotreba kompleta za miniprep (obično centrifuge) jednog od nekoliko dobavljača ( Qiagen, Promega, Bio-Rad, itd.) Koji su prilično povoljni po cijeni od 1-2 USD po pripremi.

Ako se dobro sjećam, alkalna liza * je * osnovna metoda koja stoji iza Qiagen kompleta za pročišćavanje DNA (miniprep, itd.). Pomoću rotacijskih stupaca iz kompleta možete izrezati alkoholne oborine i sušenje. Možda ne zvuči previše, ali vrijedi cijenu kompleta jer uklanja više od 10 minuta i osjetljiv korak iz protokola. Moja dva centa: ne želite koristiti fenol u učionici.
Svi preparati koje sam koristio (Qiagen, Promega, Invitrogen) koriste alkalnu lizu. Volim kolone samo zato što ne moram brinuti da li ću potpuno ispariti sav etanol (koristim ih s vakuumskim razdjelnikom pa sisam dodatnih minutu ili dvije da sve ispari) ili tražim neku napola nevidljivu kuglicu .
Ako mi se ovo još jednom svidjelo, pronašao sam recepte qiagen na Open Wet Ware .. http://openwetware.org/wiki/Miniprep/Qiagen_kit, osjećam se bolje kad ga koristim u nastavi.
#2
+6
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mislim da su kompleti okretanja stupaca pravi put. Kao što je već spomenuto, blagodati ovih kompleta su u tome što su jednostavni, sigurni i (što je najvažnije) kako danas gotovo svaki stvarni laboratorij pročišćava plazmide.

Najveća kritika komercijalnih kompleta je što se lako možete snaći, a da ništa ne znate o tome što se zapravo događa u cijevi. Međutim, kao što je navedeno u komentarima na odgovor Nicka T-a, u setovima nema tajne zaštićene tehnologije - oni koriste metodu alkalna liza . To znači da još uvijek možete podučavati mehanizam u razredu dok ćete imati koristi od okretanja stupaca.

Jedna je mogućnost u nastavne svrhe napraviti sva svoja rješenja i samo koristiti stupce okretanja na supernatant nakon peletiranja istaložene membrane / proteina. Na taj način dobivate prednost inzistiranja na pravim imenima za rješenja (NaOH je edukativnije ime od P2) i dobivate kolutove za okretanje umjesto taloženja etanola. Vjerujem da postoje jeftini izvori koji prodaju samo stupce za okretanje, iako ih nikada nisam koristio. Želite izbjeći taloženje etanola jer protokolu daje najmanje 30 minuta (za moje protokole to je bilo više od 1,5 sata ili više). A čekanje da etanol ispari kako biste mogli resuspendirati je poput gledanja boje koja se suši, osim ako imate usisavač brzine.

Prinos ne bi trebao predstavljati veliki problem u klasi, ali stupac možete povećati prinos produljivanjem završnog koraka elucije. Mislim da je dana uputa da TE pufer (Tris) "eluira" 1 minutu prije konačnog okretaja, ali rutinski sam pustio TE da odstoji oko 15-30 minuta prije nego što se zavrti. Razlika u iskorištenju izbacila je ekspoziciju na gel kameru.

Postoje određeni slučajevi u kojima su ekstrakcije fenola i kloroforma još uvijek poželjne, ali ovo definitivno nije jedan od njih. Nekad sam radio P: Cs rutinski kad sam radio s RNA i genomskom DNA kvasca. Nikad nisam vidio da je netko radio nešto drugo osim miniprepa pri pripremi plazmida. Štoviše, gnjavaža s radom u nape i rizik od opeklina fenola potaknuli su puno ljudi u laboratoriju da preferiraju spinove čak i kada rade s genomskom DNK.

nakon određenog napora prešli smo na spinove ...
#3
+4
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Prema mom iskustvu, metoda P: C: I donijet će vam veće prinose i malo je jednostavnija (u koracima i kemijskim proizvodima), ali kao što je rekao @Mad Scientist, upotreba fenola može predstavljati problem. Ovisi o dobi vaših učenika.

Nije to samo dob učenika, ona također ovisi o raspoloživim sadržajima. Potrebna vam je, primjerice, napa, a na raspolaganju vam mora biti usluga odlaganja fenola.
Fenol i kloroform su vrlo toksični i kancerogeni te ih studenti definitivno ne bi trebali koristiti ili izvan odgovarajuće nape.
#4
+4
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Koristeći spin kolone, moj profesor i ja izvukli smo ~ 30 plazmida iz ~ 30 uzoraka u nekoliko sati. Jednostavno je, jeftino i daje plazmid dobre kvalitete. Moj je uzorak kvantificiran UV spektrom i iznosio je oko 200ng / ul.

#5
  0
George
2014-02-01 08:25:24 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Da biste uštedjeli na trošku, kolone za okretanje možete kupiti sami od dobavljača kao što je Syd Labs ( http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ) i napravite domaće odbojnike. Dobavljači obično daju recepturu pufera.



Ova pitanja su automatski prevedena s engleskog jezika.Izvorni sadržaj dostupan je na stackexchange-u, što zahvaljujemo na cc by-sa 3.0 licenci pod kojom se distribuira.
Loading...